Techniques d’observation microscopique en biologie cellulaire
1)Performances des microscopes
- Microscopes photoniques
Pouvoir séparateur : d = 0.61λ / n sin(α)
Principe du microscope photonique
Le pouvoir séparateur se doit d’être le plus faible possible. Ainsi le grossissement en est meilleur.
Le microscope photonique reste limité à une longueur d’onde de 0.4 μm ≤ λ ≤ 0.8 μm
- Microscopie à contraste de phase.
Deux ondes en phase : les objets colorés vont changer la phase de la lumière incidente. Décalage de phase dans l’image. L’objet doit être cependant coloré. L'image obtenue a beaucoup plus de contraste qu'en microscopie photonique classique.
- -Polarisant, à fond noir, à fluorescence
Autres méthodes utilisées pour l’observation à partir de microscopes photoniques. La polarisation se sert du caractaire ondulatoire de l’optique pour obtenir une « coloration » de l’objet étudié.
- MET, MEB, Microanalyse X
Principe du microscope électronique
Le vide est nécessaire dans l’appareil.
Les échantillons ne doivent pas dépasser 10 nm d’épaisseur.
Les échantillons se détériorent très vite. Cependant, le ME va grossir 1000 x plus que le microscope photonique.
Flux d'électrons en microscopie électronique
Les électrons traversent l’échantillon : les atomes C, O, N, H ne les stoppent pas ou peu. Il faut donc avoir recours à des métaux lourds pour observer quelque chose.
Le microscope électronique à balayage (MEB) récupère les électrons secondaires émis à partir de la matière, il se crée ainsi une image avec impression de 3D.
Le microscope électronique à transmission (MET), quant à lui, ne donne qu’une image obtenue par saturation de l’objet en sels d’uranium. L’écran renvoie les électrons grâce à des sels de baryum. On obtient une image en 2D, allant du clair (peu d’uranium) au sombre (zones vides où l’uranium s’est accumulé.
2) Techniques préparatoires
Les techniques varient quelque peu en histologie classique ou en histologie électronique:
Histologie classique:
a) La fixation tue les cellules pour conserver les tissus.
b) La déshydratation exclue l'eau des tissus par l'emploi d'alcools de titre croissant. Le solvant final peut être du toluène.
c) Inclusion dans de la parrafine à 60°c.
d) Coupe du bloc: des tranches de 2 à 10 µm au microtome.
e) Coloration nécessitant une réhydratation pour utiliser des colorants hydrosolubles. Des alcools de titre décroissant sont utilisés.
f) Montage: permet de rendre la préparation permanente par ajout de résine.
Histologie électronique:
a) La fixation permet de conserver les tissus. Exemples de fixateurs : le tétraoxyde d’osmium OsO4 et le glutaraldehyde C5H8O2.
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Réaction chimique du Tetraoxyde d'Osmium |
Ce sont les deux principaux fixateurs chimiques utilisés en microscopie électronique.
b) Déshydratation : elle suit le même principe qu'en histologie classique; mais elle est délicate car les tissus doivent être conservés jusqu'au niveau moléculaire.
c) L' inclusion imprégnation de résine. Une fois refroidi, durci par polymérisation, on obtient un échantillon solide.
d) Coupes : la résine ou la paraffine sont coupées en fine tranches à l’aide de microtomes, couteaux d’acier, ultramicrotomes…
- Coloration négative
2 éléments : molyodène Mo et tungstène W. Dissous dans un acide : l’acide phosphomobylique ou phosphotungsteique selon le cas.
On éponge l’excédent de liquide. Seuls C, H, O et N sont alors traversés par les électrons. On a une impression de relief.
- Ombrage
Support transparent aux électrons. On y pose l’échantillon. On y fait passer un vent de platine Pt en y appliquant le vide. Le métal s’accumule selon une orientation précise. On observe les dépôts au MET. On obtient une impression de silhouette.
- Cryofracture
Geler l’eau d’un élément biologique sans y former de cristaux (vers –180 °C) : glace amorphe.
Les cassures se forment au niveau des membranes pauvres en eau. Permet d’observer l’intérieur des membranes en y appliquant un dépôt de carbone puis un ombrage de platine.
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Principe de la Cryofracture |
3) Les colorants utilisés
En microscopie photonique, différents colorants peuvent être utilisés suivant des buts différents:
- Mise en évidence de molécules
- Mise en évidence d'organites (colorations vitales)
- Colorants histochimiques
